北京脑科学与类脑研究中心（CIBR）熊巍实验室在 Cell 子刊 Cell Reports 上发表了题为：Template-independent genome editing in the Pcdh15 av-3j mouse, a model of human DFNB23 nonsyndromic deafness（不依赖于修复模板的基因编辑应用于Pcdh15^av-3j小鼠品系，一个人类非综合性耳聋DFNB23的动物模型）。

首次在哺乳动物模型上展示了利用非同源末端连接（NHEJ）的基因修复通路有效实现先天性遗传疾病的在体基因治疗。

DNA水平基因修复成为下一代基因治疗新方向

基因治疗是治疗基因突变导致的遗传性疾病的金钥匙，目前大部分工作集中在针对mRNA的基因替代（Gene replacement）或者基因沉默（Gene silence），若干适用性好的靶基因已经被用于临床，体现出基因治疗的可行性。然而就中心法则而言，在mRNA水平的修复还是治标不治本，因此针对DNA的基因修复代表了下一代基因治疗的新方向，本研究提出特别针对DNA移码突变的一个方案，并系统展示了在耳蜗毛细胞DNA水平的基因编辑有效恢复动物听觉。

DNA水平的基因修复是以CRISPR-Cas为代表的基因编辑技术来实现，随着2011年CRISPR-Cas工具的开发成熟，研究者可以依赖guide RNA（gRNA）实现稳定可控的定点DNA双链切割/断裂（DSB），CRISPR-Cas技术的一个重要应用就是实现定点切除致病突变。DSB的修复有诸多通路，其中最主要的是NHEJ和同源重组修复（HDR）两种：NHEJ产物携带各种插入或者缺失（InDel）导致的移码突变，其结果等同于从一个突变到多种突变，因此没有得到基因治疗的很好应用；依赖HDR修复通路将靶基因修复为野生型，但是这一过程需要有一个野生型的DNA模板，然而在体情况下基于HDR通路的修复效率在活体动物的终端分化细胞上效率非常低，从一定程度上限制了基因编辑在基因治疗上的应用。因此基于基因编辑技术的在体基因治疗方案一直处于实验室和细胞系体系研究阶段。

首次在哺乳动物模型上展示了利用NHEJ基因修复通路实现先天性遗传疾病的在体基因治疗

自2016年以来，陆续有基于细胞系的研究表明gRNA-spCas9酶切割产生的DSB的末端连接产物并非随机，而是可以预测和重复实现的，那么基于这一原理，对于某一个gRNA所获得DNA编辑事件可以预测，反过来说可以根据DNA产物需要来选择gRNA。然而这一规律在体内的实际情况是怎么样的并不知道，该研究即利用小鼠耳蜗培养组织验证了终端分化的功能细胞上编辑产物也具有可重复性，并利用该原理实现了单个gRNA即可修复移码突变，实现小鼠的在体基因治疗。

本研究展示了接收声音振动的听觉毛细胞可以利用内源性DNA修复通路中的最主要方式NHEJ（大于90%）修复InDel导致的移码突变，在遗传性耳聋动物模型（Pcdh15^av-3j小鼠，携带一个腺苷的插入突变）上实现了导入单个gRNA有效修复该插入导致的遗传性耳聋，而PCDH15蛋白是毛细胞tip link的组分，是毛细胞机械转导通道开放的关键蛋白，蛋白质量有215kD之巨。该概念的成功验证提示占人类22%的移码突变导致的遗传性疾病有广阔的治疗前景。

从体外组织和在体动物两个层面展示通过NHEJ通路实现移码突变的修复以及听觉和平衡觉功能的部分修复

熊巍实验室长期研究耳聋相关基因的生理和病理机制，本工作利用一株模拟人类DFNB23遗传性耳聋的Pcdh15^av-3j小鼠品系，全方位系统的展示了突变位点附近产生的DSB可以通过NHEJ通路实现移码突变的修复以及听觉和平衡觉功能的部分修复。本研究在体外组织和在体动物两个层面，从编辑基因产物、蛋白表达、毛细胞功能、以及动物生理功能等多个角度的分析和评估来展现该方案的可行性。

组织层面：

耳蜗毛细胞的基因递送一直是一个难点，熊巍博士早前开发了一套耳蜗组织培养和基因电转递送的系统解决方案（Xiong et al., Nat. Protoc. 2014），实现在培养的耳蜗组织上通过电转（较大规模）向毛细胞导入外源基因，后续通过电生理或者钙成像研究特定基因干预后的毛细胞功能变化。基于该耳蜗电转技术，熊巍实验室首先扫描了av-3j突变（1bp插入）上下游15bp的区域内的4条gRNA所产生的编辑产物，发现其中的m-3j-gRNA1表现出高比例的1bp删除的编辑产物，而且重复性很高，意味着m-3j-gRNA1是一个潜在的治疗av-3j突变的备选gRNA。在培养的Pcdh15^av-3j耳蜗组织上，通过电转表达了spCas9和m-3j-gRNA1的Pcdh15^av-3j毛细胞可以恢复PCDH15蛋白的表达（Pcdh15^av-3j突变导致PCDH15不表达上膜），同时Pcdh15^av-3j毛细胞的机械转导功能也有所恢复。有意思的是，在包括-1bp、-4bp、+2bp等在内的回码（frame-restored）产物类别中，其最高占比产物均对PCDH15功能有明显恢复，提示蛋白修复产物在非保守区即使1-2氨基酸的插入或者删除并非绝对无功能，从转化角度考虑也是值得去开发的一种可能性。

在体层面：

根据体外研究的效果，熊巍实验室进一步对Pcdh15^av-3j小鼠在体耳蜗注射包裹有m-3j-gRNA1的AAV2/9。通过对电转耳蜗组织（体外）和病毒注射耳蜗组织（在体）的基因编辑产物进行的系统比对，发现它们无论是在主编辑产物还是产物的比例上均非常一致。进一步的对m-3j-gRNA1病毒注射小鼠的各方面指标的评估，包括耳蜗毛细胞的PCDH15表达（蛋白表达）、耳蜗毛细胞的机械转导电流（细胞功能）、小鼠的听性脑干电位（ABR，听觉生理）和惊吓反应（Startle，行为学）等，均显示单个m-3j-gRNA1在spCas9的帮助下即可实现av3j突变的功能性恢复。熊巍实验室同时也检验了前庭器官的恢复效果，结果显示Pcdh15^av-3j小鼠在注射m-3j-gRNA1后也得到了平衡功能的恢复。

为基于基因编辑技术的在体基因治疗提供进一步支持

基因药是继化学药之后的基础和临床各机构研发的下一代药物的重点方向，在人体基因递送和基因表达等技术门槛陆续解决的情况下，遗传性疾病的基因治疗的前景越来越明确。2012年CRISPR-Cas技术的横空出世，提供了有效且实用的DNA编辑工具，让面向DNA的在体基因治疗成为可能。化学药和基因替代/沉默等手段通常只能做到治标不治本，而面向DNA的基因编辑带来的基因修复，可以让被修复基因跟随生命体的生长节奏在时间上和空间上实现内源表达调控，是最自然的基因表达和调控的体现，也应该是最理想的针对遗传性疾病的修复方式。

研究历程

熊巍实验室在2015年建立实验室之时即确立了研究遗传性耳聋基因治疗的方向，所有的技术和资源都是从零开始积累，期间尝试了多种策略和方法，最终锁定利用到NHEJ的非随机修复机制来重塑移码突变导致的致聋突变。本工作从2019年底投稿到2022年上半年最终接收，历时2年半，不可谓不艰难，不过“凡是过去，皆为序章”！

该论文的共同第一作者为刘恋、邹林志和李宽三位博士研究生，本工作也得到南方科技大学陈放怡实验室、山东大学徐志刚实验室和清华大学孙前文实验室的大力协助，论文通讯作者为熊巍。